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Our Planet Reviewed - Expedition Papua New-guinea

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Le devenir d’un spécimen de mollusque récupéré lors de l’expédition

Niveau de seconde et 1S

Approche SVT

Le devenir d’un spécimen de mollusque récupéré lors de l’expédition

Le devenir d’un spécimen de mollusque récupéré lors de l’expédition

[© Nicolas Puillandre]

 

Objectifs :

Montrer aux élèves comment est extrait l’ADN à partir des tissus de spécimens récoltés lors des missions puis quelles sont les manipulations effectuées dessus (PCR, séquençage) avant de pouvoir les exploiter. Cette fiche peut notamment servir à illustrer la réplication de l’ADN via la PCR mais aussi à explorer la structure de la cellule pour bien comprendre les étapes d’extraction de l’ADN.  

Contexte :

Lors des expéditions, les scientifiques du Muséum National d’Histoire Naturelle vont récolter un certain nombre de spécimens qui seront inventoriés et classifiés. En plus de cette classification macroscopique, l’ADN de ces spécimens sera aussi analysé principalement afin de les classer de manière phylogénétique. Pour cela une partie de leurs tissus sera prélevée dans le but d’en extraire l’ADN.

Nous prendrons ici l’exemple d’un mollusque comme spécimen et aborderont 4 étapes : le prélèvement du tissu  l’extraction de l’ADN, l’amplification de l’ADN par PCR (nécessaire à son utilisation et pouvant servir de base à la compréhension de la réplication), le séquençage de cet ADN. Enfin des pistes d’utilisations des données générées seront évoquées. 

Documents :

Doc 1 : Manipulations sur le terrain

Photographie du spécimen : 

Le spécimen doit d’abord être photographié pour pouvoir garder une trace de son aspect macroscopique vivant. Pour cela :

1) Le spécimen est nettoyé au pinceau, en particulier la coquille

2) Le spécimen est photographié vivant dans de l’eau sur un fond noir

3) Après le prélèvement du tissu, la coquille sera séchée et conservée. De retour au laboratoire, elle sera photographiée sur fond noir.

[© Barbara Buge | MNHN]

 
Exemple de spécimen de mollusque

Exemple de spécimen de mollusque

[© Barbara Buge | MNHN]

 
Exemple de dispositif photographique pour la prise de vue des spécimens

Exemple de dispositif photographique pour la prise de vue des spécimens

[© Tin-Yam Chan | MNHN]

 
Exemple de coquille photographiée sur fond noir d’un <i>Turridae</i>

Exemple de coquille photographiée sur fond noir d’un Turridae

[© Barbara Buge | MNHN]

 

Prélèvement de tissu chez un mollusque :

Pour prélever les tissus, il est important de travailler avec du matériel propre afin d’éviter les contaminations par d’autres ADN. Idéalement, le matériel devrait être stérilisé avec une flamme ou à la javel mais sur le terrain le matériel est souvent simplement passé à l’alcool (moins efficace).

Pour les spécimens de mollusques sans coquille, un morceau de tissu peut directement être prélevé et mis dans de l’alcool supérieur à 95°C pour la conservation.

Dans le cas d’un spécimen avec une coquille plusieurs options sont possibles :

 

  • Le spécimen peut être anesthésié dans du MgCl2 (ce qui va relâcher les muscles) pendant environ 2 h à 4°C
  • Ou le spécimen peut être plongé 1 à 2 minutes dans de l’eau bouillante afin de forcer l’ouverture ou la sortie de la coquille
  • Ou en cas d’échec des 2 premières méthodes notamment si le spécimen a un opercule qui se ferme à l’entrée de la coquille, il faut percer la coquille afin de pouvoir prélever du tissu :

 

a) Percer la coquille à l’opposé de l’ouverture

b) Vérifier que le spécimen ne s’est pas rétracté plus haut

c) Pousser le tissu hors de la coquille à l’aide de pinces et d’un morceau de serviette en papier humidifié l’alcool. Récupérer idéalement tout le tissu mais si c’est impossible au moins 30mm3

Une nouvelle méthode a récemment été mise au point. Elle consiste à passer de quelques secondes à quelques minutes le spécimen au micro-onde ce qui permet l’ouverture ou la sortie de la coquille évitant ainsi l’étape fastidieuse de perçage de la coquille. Cependant cette technique n’est pas accessible dans certains cas (il est rare d’avoir un micro-onde sur un bateau).

Spécimens plongés dans du MgCl2

Spécimens plongés dans du MgCl2

[© Barbara Buge | MNHN]

 

Conservation des tissus :

Le tissu extrait est placé dans de l’alcool supérieur à 90°C et conservé dans les tubes vissés à bouchon rouge. Le surplus de tissus est soit placés dans les pots à bouchons jaunes ou les sachets plastiques avec de l’alcool à 80°C

Les échantillons sont soigneusement identifiés, numérotés et associés à leur photo. Ils sont ensuite conditionner pour être envoyés aux collections du Muséum national d’Histoire naturelle.

Conservation et conditionnement des tissus dans de l’alcool

Conservation et conditionnement des tissus dans de l’alcool

[© Barbara Buge | MNHN]

 

Doc 2 : De retour au laboratoire, travail sur l’ADN 

Extraction d’ADN :     

L’ADN que l’on souhaite extraire se trouve au sein du noyau de la cellule. Afin d’extraire cet ADN, il va falloir lyser les cellules afin d’en libérer l’ADN. 

La cellule possède de nombreuses membranes dont notamment la membrane plasmique qui entoure la  cellule et la membrane nucléaire. Ces membranes protègent la cellule et isolent les différents compartiments. Ces membranes sont constituées majoritairement de lipides qu’il faut solubiliser afin de libérer le contenu de la cellule. 

De plus dans la cellule, il y a un grand nombre de protéines qu’il faut séparer de l’ADN afin d’obtenir de l’ADN purifié, indispensable pour pouvoir effectuer les différentes analyses.

Comment réaliser la libération puis la purification de l’ADN ? Peut-on s’appuyer sur les propriétés de solubilité (hydrophile ou hydrophobe) des différentes molécules (lipides, protéines, ADN) puis le mettre en lumière par rapport au protocole d’extraction d’ADN exposé ci-dessous ?

 

Extraction d’ADN

Extraction d’ADN

[© Laëtita Préau | MNHN]

 

 

Amplification de l’ADN :

Afin de pouvoir utiliser l’ADN préalablement extrait, il est nécessaire de l’amplifier afin d’en augmenter la quantité disponible. En effet après l’extraction, on obtient une petite quantité d’ADN génomique qui n’est pas suffisante pour la plupart des analyses. On ne va pas amplifier tout l’ADN génomique mais seulement le ou les fragments qui nous intéressent. Pour cela on utilise la PCR (Polymerase Reaction Chain) qui se base sur le même principe que la réplication de l’ADN.

 

 

Amplification de l’ADN

Amplification de l’ADN

[© Laëtita Préau | MNHN]

 

 

 

La PCR est une technique qui imite ce que l’on sait de la réplication et qui implique les mêmes éléments (ouverture de l’ADN, amorces, polymérases). Pour cela on va répéter les cycles de température : 92°C -55°C -72°C pour réaliser plusieurs cycles de synthèse et ainsi copier les molécules d’ADN afin de les obtenir en très grand nombre. On obtient théoriquement 2n copie d’ADN par cycle avec n correspondant au nombre de cycle. On fait en moyenne 30-40 cycles. Cependant ce rendement n’est pas forcément optimal et est surtout limité à un certains nombres de cycles car au bout d’une vingtaine de cycle la quantité de polymérase devient un facteur limitant puis par la suite on atteint un plateau quand les nucléotides viennent à manquer.

La PCR peut être utilisée sur tous les êtres vivants de la bactérie à l’Homme en passant par les végétaux. Cet état de fait montre bien que l’ADN est présent dans tous les êtres vivants où il a la même structure et que les mécanismes de sa réplications sont très similaires ce qui montre bien son « universalité » et l’unicité du vivant.

Doc 3 : Les applications de cette extraction d’ADN 

Séquençage et analyse de l’ADN

Après l’amplification du fragment d’ADN d’intérêt, celui-ci peut ensuite être séquencé (c’est-à-dire décoder l’enchainement de sa séquence en base azotées). Dans le cas du Museum national d’Histoire naturelle, la plupart des échantillons sont séquencés au Genoscope à Ivry. Après le séquençage, la séquence est généralement rentrée dans une base de données.

A partir des séquences amplifiées, différentes analyses sont possibles :

 

  • Les séquences peuvent être utilisées en complément d’autres caractères (morphologique, géographique, écologique….) pour faire de la taxonomie. La taxonomie est la science qui s’occupe de  décrire, d’identifier, de classer en taxon et de nommer les organismes vivants. Cela permet en fait de savoir à quelle espèce peut appartenir un nouvel organisme vivant  découvert ou si c’est une nouvelle espèce.
  • Les séquences peuvent être utilisées pour réaliser de la phylogénie moléculaire. Les séquences vont être alignées avec des séquences homologues d’autres organismes. On peut alors regarder les bases conservées et les bases différentes et comparer les séquences entre elles pour ensuite construire un arbre phylogénétique. La phylogénie permet de retracer les relations de parenté entre les différents taxons. (Liens avec les fiches sur la phylogénie).
  • Depuis quelques années sont aussi mises en place des approches dites de barcoding. Le barcoding permet d’identifier une espèce à partir de seulement un fragment d’ADN. Pour cela il faut créer des bases de données contenant la séquence des espèces déjà connues. Le fragment d’ADN que l’on choisit pour ces études possède la particularité d’être présent dans tous les organismes vivants et d’être très similaire chez les individus d’une même espèce alors qu’il est plus différent entre des individus d’espèces différentes.

 

C’est par exemple le cas pour le gène du génome mitochondriale qui code pour la première sous unité d’une protéine intervenant dans la chaine respiratoire de la mitochondrie : le  cytochrome oxydase (COI). Au niveau de ce gène les différences de séquences des individus d’une même espèce sont faibles alors qu’elles sont très élevées entre individus d’espèces différentes. Ainsi cette séquence peut servir à l’identification d’individus inconnus puisque leur séquence va être proche de celle des individus de la même espèce qu’eux.

Au cours des missions scientifiques, l’objectif va être de prélever le tissus d’un maximum de spécimens pour pouvoir séquencer après au laboratoire des gènes du type de COI afin d’augmenter la couverture de la base de données qui est ensuite utilisée pour identifier des spécimens inconnus.

Doc 4 : Historique de la technique de Polymeras Chaine Reaction (PCR) 

La PCR a bénéficié des avancées réalisées au cours de la deuxième moitié du 20ème siècle. 

En effet, à partir de l’élucidation de la structure de l’ADN par Watson et Crick en 1953 (Prix Nobel - 1962), un certain nombre de découvertes importantes vont s’enchainer…

Les travaux d’Arthur Kornberg ont permis de commencer à comprendre les mécanismes de la réplication, il a notamment découvert chez E. coli l’ADN polymérase I, responsable de la réplication de l’ADN (Prix Nobel - 1959).

Dans les années 1960, Gobin Khorana travailla sur le code génétique et la possibilité de synthétiser de l’ADN in vitro. Il mit au point les premiers oligonucléotides, qui sont de petits fragments d’ADN (20-50bp) synthétisés chimiquement, qui servent actuellement d’amorces lors de la PCR.

En 1971, Kjell Kleppe, un chercheur de l’équipe de Khoran décrit pour la première fois un processus proche de la PCR :

“ ... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme”.

“… On peut espérer obtenir 2 complexes chacun contenant la totalité du brin matrice correctement apparié avec le primer. L’ADN polymérase  va être ajouté pour compléter le processus de réplication. On aura alors 2 molécules du double brin original. La totalité du cycle peut être répété en ajoutant à chaque fois une nouvelle dose d’enzyme  “

Cependant c’est Kary Bank Mullis qui publie un premier article sur la PCR en 1986. Il recevra pour cela le prix Nobel en 1993.

Dans les débuts, les réactions de PCR se réalisaient avec un fragment de l’ADN polymérase I d’E. coli. Cependant comme cette enzyme n’était pas thermostable, il fallait ajouter l’enzyme à chaque nouveau cycle après la dénaturation ce qui était lourd pour l’expérimentateur et pouvait être source de contamination. C’est pour cela qu’à partir de 1988 on commence à utiliser une ADN polymérase thermorésistante issue de la bactérie Thermus aquaticus qui vit en eau chaude : c’est la Taq polymérase.

L’utilisation de la Taq polymérase et le développement des thermocycleurs (machines faisant varier rapidement la température) ont permis d’automatiser la technique qui est maintenant utilisée en routine dans la plupart des laboratoires.

Compétences pouvant être mise en œuvre :   

Seconde : 

La nature du vivant (attitudes et capacités)

Manipuler, modéliser, recenser, extraire et organiser des informations pour mettre en évidence l’universalité de l’ADN.

Mettre en œuvre une méthode (démarche historique et/ou utilisation de logiciel et/ou pratique documentaire) permettant d’approcher la structure de l’ADN et la nature du message codé.

1S : 

Thème 1 : Reproduction conforme de la cellule et réplication de l’ADN 

Mettre en œuvre une méthode (démarche historique) et/ou une utilisation de logiciels et/ou une pratique documentaire permettant de comprendre le mécanisme de réplication semi conservative. 

Pistes. Comprendre la PCR. Calculer la vitesse de réplication chez les eucaryotes.

Bibliographies indicative :

Sites Web 

Site de Kary Bank Mullis : http://www.karymullis.com/

Protocole de récolte des échantillons du MNHN : http://collections.mnhn.fr/wiki/Wiki.jsp?page=Marbol_Manual

Animation sur la réplication : http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.fr.html

Article scientifique :

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73.